زنان نابارور ایرانی. مطالعه ارتباط پلیمورفیسم ژن ESR-β در سویار ساری گلنار ساری مقاله اصلی

Transcript

1 Medical Journal of Mashhad University of Medical Sciences Vol. 59, No. 3 P: Sep-Oct 2016 مجله دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي مشهد سال 95 شماره 4 مهر- آبان 59 صفحه مقاله اصلی مقایسه مطالعه ارتباط پلیمورفیسم ژن ESR-β در زنان نابارور ایرانی تاریخ دریافت: 59/4/02 تاریخ پذیرش: 59/6/ * سویار ساری گلنار ساری 1- استادیار دکتری تخصصي زیست شناسي سلولي وملكولي گروه آموزشي علوم سلولي مولكولي دانشكده علوم و فناوریهای نوین واحد علوم دارویي دانشگاه آزاد اسالمي تهران ایران 0- کارشناسي ارشد مهندسي شیمي گروه مهندسي شیمي دانشكده فني و مهندسي واحد تهران مرکزی دانشگاه آزاد اسالمي تهران ایران * تهران گروه آموزشي علوم سلولي مولكولي دانشكده علوم و فناوریهای نوین واحد علوم دارویي دانشگاه آزاد اسالمي خالصه مقدمه ناباروری یک بیماری است هورمون استروژن یكي از هورمون هایي است که نقش مهمي در باروری ایفا ميکند. گیرنده استروژن بتا توسط ژن کد ميشود. انتظار ميرود تغییرات ژنتیكي در ژن گیرنده استروژن موجب ناباروری گردد. ازاین رو.این مطالعه با هدف بررسي پليمورفیسم ژن ESR-β در. زنان ایراني انجام شده است. روش كار ناباروری دراین مطالعه مورد شاهدی که در آزمایشگاه های طبي تهران درسال 1954 انجام شده است از 92 زن نابارور و 22 زن سالم به عنوان کنترل نمونه خون تهیه شد. بعد از استخراج DNA جهت تعیین پليمورفیسم ژن ESR-β روش PCR-RFLP با آنزیم RSa1 مورد استفاده قرار گرفت. جهت تعیین معنادار بودن تفاوت ژنوتیپها در دو گروه بیمار و کنترل از آزمون کای مربع استفاده شد. نتایج فراواني آللهای A وG در افراد نابارور و سالم 2/9=P بود. که اختالف معناداری در فراواني اللي بین افراد نابارور و سالم به دست نیامد. افراد نابارور با فراواني ژنوتیپ AA وGG 2/2=P ارتباط معناداری با بیماری ناباروری نشان ندادند. اما بیماراني با ژنوتیپ هتروزیگوت =P 221/ AG افزایش معناداری با بیماری نشان دادند. نتیجه گیری نتایج مطالعه حاضر بیانگر شواهدی مبني بر همراهي پليمورفیسم ژن گیرنده استروژن بتا در افرادی با ژنوتیپ AG و ناباروری ميباشد. كلمات كلیدی: استروژن پليمورفیسم ناباروری PCR-RFLP sari.s@iaups.ac.ir تلفن: پی نوشت: این مطالعه فاقد تضاد منافع مي باشد.

2 م- جله دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي مشهد مهر- آبان 59 شماره 4 سال مقدمه ناباروری به ناتواني زوجین در باروری پس از.گذشت یک سال از مقاربتهای منظم و بدون استفاده از روشهای پیشگیری از بارداری گفته ميشود) 1 0 (. از دالیل عمده ناباروری ميتوان به ناهنجاریهای ژنتیكي و عوامل محیطي واختالل در عملكرد هورمونهای جنسي اشاره کرد) 9 4 (. استروژن یكي از هورمونهای جنسي مي باشد که اختالل در ژن کد کننده گیرنده آن مي توانند باعث ناباروری گردد. گیرنده استروژن بتا ایزوفرمهای گیرنده استروژن است. که توسط ژن )ER-B( یكي از )گیرنده استروژن 0( کد ميشود) 5-9 (. این ژن روی بازوی بلند کروموزوم 14 واقع شده و 2 اگزون دارد) 12-2 (. عملكرد هورمون استروژن از طریق اتصال به گیرنده خود مي باشد در نتیجه هر گونه تغییر در ژن کد کننده گیرنده بتا مي تواند باعث عدم عملكرد هورمون استروژن و در نهایت منجر به ناباروری شود) (. اهمیت این بررسي و توجه ما به پليمورفیسم ژن رسپتور استروژن بتااز یک سو معطوف به نقش مهم آن درایجاد بیماریهای زنان در ایران و همچنین عدم وجود مطالعاتي همانند تحقیق حاضر در خصوص ارتباط پليمورفیسم ژن استروژن رسپتور بتا با ناباروری زنان درکشور ضرورت انجام این تحقیق را افزون کردهاست. لذا هدف ازتحقیق حاضر بررسي ارتباط پليمورفیسم ژن استروژن رسپتور بتا با ناباروری در زنان ایراني است. روش كار در این مطالعه مورد- شاهدی 192 خانم ایراني شامل 92 خانم نابارور که فاقد فرزند بوده و پس از.گذشت از سال یک مقاربتهای منظم و بدون استفاده از روشهای پیشگیری قادر به باروری نبودند و 22 خانم به عنوان کنترل سالم با حداقل سابقه یک فرزند که نمونه های خون آنها در سال 1954 در آزمایشگاههای تشخیص طبي در شهر تهران که کامال مجهز به تكنیک ملكولي بودند مورد بررسي قرار گرفت. همچنین سطح هورمون محرک فولیكول 1 )FSH ( chemiluminescent اندازه گیری شد. مبنای بیماران اندازه توسط گیری هورمون محرک فولیكول به دلیل این است که این هورمون ضروری برای فعالیت طبیعي گنادهاست و برای صحت عملكرد گنادها اندازه گیری این هورمون انجام گرفت. پس از دادن آگاهي و کسب رضایت نامه 4 میلي لیتر خون محیطي از افراد مورد مطالعه در لوله های حاوی EDTA DNA گرفته شد. استخراج با روش نمک زدن صورت گرفت. DNAی استخراج شده تا زمان تحلیل در دمای 02- درجه سانتي گراد نگهداری شد )14 19(. تعیین ژنوتیپ ERB پليمورفیسم )1220 )G>A واکنش زنجیره پلیمراز) )PCR 0 09 درژن گیرنده استروژن بتا به وسیله و هضم آنزیم محدودگر rs= Rsa1 مشخص شد. واکنش زنجیره پلیمرازدر حجم پلیمراز میكرولیتر حاوی 10/9 )Master mix PCR) میكرولیتر مخلوط واکنش زنجیره 0 میكرولیتر از هر پرایمر پیشرو و پیرو و 0 میكرولیتر از DNA الگو صورت گرفت. تكثیر در 92 سیكل و تحت دماهای 54 درجه سانتيگراد به مدت 1 دقیقه 64 درجه سانتيگراد به مدت 1 دقیقه و 50 درجه سانتيگراد به مدت 1 دقیقه انجام شد. دناتوراسیون اولیه به مدت 9 دقیقه در دمای 54 درجه سانتيگراد و طویل سازی نهایي به مدت 9 دقیقه در دمای 50 درجه سانتيگراد صورت گرفت. محصوالت واکنش زنجیره پلیمراز به وسیله آنزیم محدود کننده Rsa1 در دمای 95 درجه هضم شدند و سپس به وسیله الكتروفورز روی ژل اگارز %0 جدا شدند )جدول 1 توالي پرایمر نشان داده شده است() 16 (. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از نرم افزار SPSS انجام شد جهت تعیین معني دار بودن ژنوتیپ ها در 0 گروه بیمار و سالم از آزمون کای مربع استفاده شد در این ازمون 2/29>P بودن تفاوت ژنوتیپي بین گروهها در نظر گرفته شد. نتایج نشان دهنده معني دار در این مطالعه 192 نفر شامل 92 نفر زن مبتال به ناباروری و 2 Polymerase chain reaction 1 Follicle-Stimulating Hormone

3 020- ارتباط پليمورفیسم ژن ESR-β در زنان نابارور ایراني سویار ساری و گلنار ساری جدول 2- والي پرایمرها وآنزیم محدودگر هضم آنزیم )bp( توالی پرایمر آنزیم محدودگر RsaI F:5'-TCTTGCTTTCCCCAGGCTTT-3' R:5'-ACCTGTCCAGAACAAGATCT-3' G=196 A= زن سالم به عنوان کنترل بررسي شدند. پليمورفیسم )RFLP 1 ( از روش جهت تعیین پلي مورفیسم قطعات طولي محدود استفاده گردید و سپس نتایج بهدست آمده با ژل آگارز %0 بررسي شد. بررسي پليمورفیسم ESRB G>A واینبرگ را برای هر دو گروه بیمار انحراف از تعادل هاردی x 2 =02/90 P<2/221 الل گروه سالم x 2 =11/95 A وP=2/20 را نشان داد. و بر طبق نتایج حاصل از این مطالعه تفاوت معناداری در فراواني و الل 2/9=P G بین دو گروه زنان نابارور و گروه زنان سالم یافت نشد. افراد نابارور با فراواني ژنوتیپ AA و GG ارتباط معناداری با بیماری ناباروری نشان ندادند )2/2=P(. اما بیماراني با ژنوتیپ هتروزیگوت AG افزایش معناداری با بیماری نشان دادند ) P=2/221 (.و این درحالي است که افراد نابارور با ژنوتیپ AG با افراد سالم با ژنوتیپ هموزیگوت AA و هموزیگوت GG مقایسه شده بودند و همچنین ارتباطي بین سن بیماران و سطح سرمي مشاهده نشد. بحث در مطالعه حاضر ارتباط پليمورفیسم هورمون محرک فولیكول ژن ESRB با ناباروری در زنان ایراني مورد بررسي قرار گرفت. بر طبق نتایج حاصل از این فراواني بین مطالعه ژنوتیپي AG با ناباروری ارتباط زنان معناداری وجود دارد) P=2/221 (. و افراد با ژنوتیپ AG احتمال بیشتری برای ابتال به ناباروری دارند. امروزه مطالعه مباحث ملكولي گیرندههای استروئیدی به عنوان یكي از مباحث مهم مطرح است) (. در این مطالعه پليمورفیسم در ژن و ارتباط آن با ناباروری زنان مورد مطالعه قرار گرفت. این ژن روی بازوی بلند کروموزوم 14 قرار دارد.و حاوی 2 اگزون است) (. محصول این ژن ایزوفرم B از ایزوفرمهای معروف گیرندههای استروژن است..)04-00( 0 در مطالعهای لیاکات وهمكاران درسال 0219 بر روی 54 زن نابارور و 92 زن سالم در کشور پاکستان آنالیزهای ملكولي برای شناسایي پليمورفیسم در ژن برای هر دو گروه انجام شد. شناسایي نشد. اما هیچ پليمورفیسمي تمام افراد مورد مطالعه برای الل GG هموزیگوت بودند. که این نشاندهنده عدم وجود پليمورفیسم در جمعیت مورد مطالعه بود) 09 (. در مطالعه حاضر ارتباط بین سن و سطح سرمي هورمون محرک فولیكول بیماران و افراد سالم محاسبه شد.اما هیچ ارتباطي بین سن بیماران و سطح اندوکرین آنها یافت نشد.که مي توان بیان کرد که سطح گنادوتروپینها رابطه مستقیمي با ناباروری ندارند. تاکنون هیچ مطالعهای در مورد رابطه بین پليمورفیسم ژن در زنان ایراني نابارور انجام نشده است. لذا دراین مطالعه برای نخستین بار به بررسي تاثیر پليمورفیسم ژن در ناباروری زنان ایراني پرداخته شده است با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه که برروی 92 زن نابارور و 22 زن سالم به عنوان کنترل صورت گرفت ميتوان گفت به احتمال زیاد ژنوتیپهای AG پليمورفیسم ژن ميتواند در استعداد ابتالی به ناباروری در زنان موثر باشد. ناباروری یک بیماری مولتي فاکتوریال مي باشد از این رو الزم است که نقش سایر عوامل ژنتیكي در بروز ناباروری بررسي شود. نتیجه گیری نتایج این پژوهش حاکي از ارتباط پليمورفیسم ناباروری زنان ميباشد.) P=2/221 ( وافراد دارای ژنوتیپ احتماال بیشتر به ناباروری مبتال ميشوند. تشکر و قدردانی با AG مطالعه حاضر نتیجه حمایت مالي نویسندگان ميباشد واز همكاری 2 Liaqat 1 Restriction Fragment Length Polymorphism

4 م- جله دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي مشهد مهر- آبان 59 شماره 4 سال کلیه بیماران و افراد سالم داوطلب شرکتکننده در این مطالعه به دلیل همكاری های الزم برای اجرای این طرح قدرداني مي گردد. References 1. Guo R, Zheng N, Ding S, Zhengy Y, Feng L. Associations between estrogen receptor-beta polymorphisms and endometriosis risk. Diagn Pathol 2014; 26: Mahdavipour M, Rajaei F, Idali F, Zarei S, Talebi S, Fatemi R,et al. Investigation on estrogen receptor alpha gene polymorphisms in Iranian women with recurrent pregnancy loss. Iran J Reprod Med 2014; 12: Jodeiry S, Vaziri H, Zahiri Z. Analysis of ESR1 rs Polymorphism with Infertility in Guilanian. Arak Med Univ J (AMUJ) 2016; 18: Kumar R, Zakharov MN, Khan SH, Miki R, Jang H, Toraldo G, et al. The dynamic structure of the estrogen receptor. J Amino Acids 2011; 2011: Lee HR, Kim TH, Choi KC. Functions and physiological roles of two types of estrogen receptors, ESR-α and ESRβ, identified by estrogen receptor knockout mouse. Lab Anim Res 2012; 28: WeiDU J, RongTao X, Yixu K, Lanqi X. Polymorphisms in estrogen receptor α are associated with idiopathic female infertility. Mol Med Rep 2011; 4: Osz J, Brélivet Y, Peluso-Iltis C, Cura V,Eiler S, Ruff M, et al. Structural basis for a molecular allosteric control mechanism of cofactor binding to nuclear receptors. Proc Natl Acad Sci 2012; 109: Anousha N, Hossein-Nezhad A, Biramijamal F, Rahmani A, Maghbooli Z,Aghababaei E, et al. Association study of estrogen receptor alpha gene polymorphisms with spontaneous abortion: is this a possiblereason for unexplained spontaneous abortion?. Biomed Res Int 2013; 2013: Quaynor SD, Stradtman EW, Kim HG, Shen Y, Chorich L, Schreihofer D. Delayed puberty and estrogen resistance in a woman with estrogen receptor α variant. N Engl J Med 2013; 369: Liu L, Tan R, Cui Y, Liu J, Wu J. Estrogen receptor α gene (ESR1) polymorphisms associated with idiopathic premature ovarian failure in Chinese women. Gynecol Endocrinol 2013; 29: Wasiu O, Adebayo A, Taiwo B. A review of female infertility: important Etiological factors and management. J Microbiol Biotech Res 2012; 2: Zulli K, Bianco B, Mafra FA, Teles JS, Christofolini DM, barbosa CP. Polymorphism of the estrogen receptor beta gene is related to infertility and infertility-associated endometriosis. Arq Bras Endocrinol Metabol 2010; 54: Pineda B, Hermenegildo C, Tarin JJ, Laporta P, Cano A, Garcia-Perez MA. Alleles and haplotypes of the estrogen receptor alpha gene are associated with an increased risk of spontaneous abortion. Fertil Steril 2010; 93: Safarinejad MR, Shafiei N, Safarinejad S. Association of polymorphisms in the estrogen receptors alpha, and beta (ESR1, ) with the occurrence of male infertility and semen parameters. J Steroid Biochem Mol Biol 2010; 122: Zulli K, Bianco B, Mafra FA, Teles J, Christofolini D, Barbosa C. Polymorphism of the estrogen receptor β gene is related to infertility and infertility associated endometriosis. Arq Bras Endocrinol Metab 2010; 54: Lee GH, Kim SH, Choi YM, Suh CS, Kim JG, Moon SY. Estrogen receptor beta gene G/A polymorphism in women with endometriosis. Fertil Steril 2007; 88: Christofolini DM, Vilarino FL, Mafra FA, André GM, Bianco B, Barbosa CP. Combination of polymorphisms in luteinizing hormone β, estrogen receptor β and progesterone receptor and susceptibility to infertility and endometriosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2011; 158: Wu CH, Yang JG, Chang YJ, Hsu CC, Kuo PL. Screening of a panel of steroid-related genes showed polymorphisms of aromatase genes confer susceptibility to advanced stage endometriosis in the Taiwanese Han population. Taiwanese J Obstet Gynecol 2013; 52: Silva RC, Costa IR, Bordin BM, Silva CT, Souza SR, Júnior CL, et al. RsaI polymorphism of the ERβ gene in women with endometriosis. Genet Mol Res 2011; 10: Ge YZ, Xu LW, Jia RP, Xu Z, Li WC, Wu R, et al. Association of polymorphisms in estrogen receptors (ESR1 and )with male infertility: a meta-analysis and systematic review. J Assist Reprod Genet 2014; 31: Gao Z, Fu HJ, Xue JJ, Wu ZX, Zhao LB. Genetic polymorphisms in VDR, ESR1 and genes may contribute to susceptibility to Parkinson s disease: a meta-analysis. Mol Biol Rep 2014; 41: Kerkhof HJ, Meulenbelt I, Carr A, Gonzalez A, Hart D, Hofman A, et al. Common genetic variation in the Estrogen Receptor Beta () gene and osteoarthritis: results of a meta-analysis. BMC Med Genet 2010; 16: Yu KD, Rao NY, Chen AX, Fan L, Yang C, Shao ZM. A systematic review of The relationship between polymorphic sites in the estrogen receptor-beta () gene and breast cancer risk. Breast Cancer Res Treat 2011; 126: Guo R, Zheng N, Ding S, Zheng Y, Feng L. Associations between estrogen receptor beta polymorphisms and endometriosis risk a meta analysis. Diagn Pathol 2014; 9: Liaqat S, Hasnain SH, Muzammil Sa, Hayat Su. Polymorphism analysis in estrogen receptors alpha ana beta genes and their association with infertile population in Pakistan. Excli J 2015; 14:

5 024- ارتباط پليمورفیسم ژن ESR-β در زنان نابارور ایراني سویار ساری و گلنار ساری Original Article Association of estrogen receptor-β Gene polymorphism with infertility in iranian women Received: 10 Jul Accepted: 31 Aug Soyar Sari* 2 Golnar Sari 1- Department of Molecular and Cellular Sciences, Faculty of Advanced Sciences & Technology, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran (IAUPS) 2- Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering, central Tehran Branch Islamic Azad University, Tehran, Iran * Department of Molecular and Cellular Sciences, Faculty of Advanced Sciences & Technology, Pharmaceutical Sciences Branch, Islamic Azad University, Tehran, Iran (IAUPS) Tel: sari.s@iaups.ac.ir Abstract Introduction: Infertility is a disease. Estrogen is a hormone that plays an important role in the fertility. Estrogen receptor beta gene codes. expected that some genetic variations in estrogen receptor Infertility can be caused. The aim of the present study was to investigate the association between ESR-β gene polymorphism and infertility in Iranian women. Methods: In this study blood samples were collected from 50 infertile women and 80 healthy women and genomic DNA was extracted. PCR- RFLP method with RSa1 was used to identify in ESR-β gene. In addition, Allelic compounds and allele frequency in the population were determined, and the relationship between the polymorphisms and infertility in the population were examined using the chi-square test. Results: The results of this study indicated that there was no significant difference in the frequency of alleles A and G (P=0/5) between infertile and healthy women. Infertile patients with genotypes of AA and GG (P=0/8) did not show any significant association with infertility. However, the patients with AG genotype (P=0/001) demonstrated a strong association with the risk of infertility. Conclusion: Our findings indicated that ESR-β gene polymorphism are more likely realeted to women with AG genotype as well as with infertility. Key words: Estrogen, Infertility, Polymorphism, PCR-RFLP Acknowledgement: There is no conflict of interest